間充質干細胞有望成為“男性不育”的終結者

男性不育癥，即夫妻雙方在未采用避孕措施的情況下正常性生活1年以上，由于男方因素而導致女方不孕。由于遺傳、環境污染等多方面因素的影響，不育癥的發病率正逐漸上升，已高達10%～15% ，成為繼腫瘤和心血管疾病之后危害人類健康和社會穩定的第3大要素。男性不育癥包括少精子癥、弱精子癥、無精子癥、畸形精子癥、白細胞精子癥和死精子癥等多種類型。目前，臨床上常用的治療方法包括: 藥物、手術和輔助生殖技術(assisted reproductive technology，AＲT) 。

藥物治療主要針對睪丸因素所致的生精功能低下，從而促進精子發生。手術治療主要針對導致男性不育的病因進行治療，包括精索靜脈曲張、睪丸下降不全和輸精管梗阻等。AＲT 技術的應用雖然讓不少不育癥患者受益，但其成功率低、睪丸或附睪取精術后常并發睪丸萎縮、附睪結節，治療效果不能完全滿足臨床的需求。此外，對于基因缺陷導致的不育，可能基因治療更為有效，但存在脫靶導致的安全性及倫理等問題，離實際應用仍有很長的距離。

目前雖然已經發現了很多引起男性不育的原因，治療手段的進步使大部分男性不育能通過AＲT技術得到糾正，但有部分患者內源性生殖細胞缺失，不能通過輔助生殖技術或藥物進行治療。間充質干細胞( mesenchymal stem cell，MSC) 因其獲取方便、增殖能力強和免疫原性低等優點，已成為再生醫學領域研究的熱點。隨著研究的不斷深入，相信MSC將為男性不育的治療提供新的思路和方法。

MSC特性及治療機制

MSC作為具有自我更新和多向分化能力的多功能細胞，存在于人體或動物個體發育的各個階段的組織器官中，是各種分化細胞或特化細胞的初始來源。MSC具有免疫調節功能和低免疫原性，異種移植能克服免疫排斥反應，長期存活。MSC能夠分泌可溶性因子和微囊泡，調節免疫細胞的功能。組織損傷時產生的趨化因子可誘導MSC的歸巢效應。另外，MSC還可分泌生物活性因子，抑制細胞凋亡，減輕炎癥及纖維化，促進血管再生。MSC主要存在于結締組織和器官間質中，具有間質細胞又有內皮及上皮細胞特征的非終末分化細胞。MSC來源廣泛，包括骨髓、臍帶、脂肪、胎盤、骨骼肌、骨膜、真皮等。

目前臨床應用相對較廣的MSC有骨髓MSC、臍帶MSC、脂肪MSC等。MSC移植作為男性不育理想的治療手段，其在睪丸微環境中的長期存活及對生精功能的修復已得到證實，其主要作用機制包括:

① MSC能通過旁分泌作用分泌營養因子(相關因子作用見表1) ，促進其他干細胞的增殖和分化;

② MSC 移植后能歸巢至損傷部位，在微環境誘導下向間質細胞和支持細胞分化，促進組織修復。

MSC在男性不育中的應用

01骨髓間充質干細胞( bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC) 治療男性不育，BMMSC是骨髓中除造血細胞以外的中胚層來源的細胞，具有自我更新及多向分化能力。其細胞特性穩定，可以分化成為肝臟、軟骨、肌肉、神經元等組織細胞。2006年，Nayernia等用轉基因小鼠提取BMMSC，經體外培養后用視黃醇進行誘導，部分BMMSC表達Oct4、Stella、Mvh、Dazl、Piwil2、Stra8、c-kit等原始生殖細胞和精原干細胞標志物，首次證實骨髓來源的MSC 能分化為雄性生殖細胞。

研究人員將這些雄性生殖細胞移植到不育小鼠睪丸內，發現移植的細胞能在睪丸內存活和增殖，部分遷移至生精小管基底膜。但移植的細胞不表達減數分裂后生殖細胞標志物，表明BMMSC 移植入體內后不能進一步分化為精母細胞和精子細胞。隨后，Lue等的研究同樣證實了這一點。Lue 等將綠色熒光蛋白(GFP) 標記的小鼠BMMSC注射入不育小鼠生精小管內，發現BMMSC能分化為精原細胞、間質細胞和支持細胞，但這些移植的BMMSC不能進行減數分裂產生精子。后來 Lassalle 等報道BMMSC移植入小鼠體內不能重建精子發生過程。在小鼠體內維甲酸的誘導下，移植的BMMSC能表達生殖細胞標志物，但不能轉分化產生生殖細胞，亦不通過減數分裂產生單倍體細胞。

另有學者將BMMSC與Sertoli 細胞進行體外共培養，發現 BMMSC 表達生殖細胞特異性標志物，然后將體外誘導的BMMSC移植入白消安處理的不育大鼠體內，部分BMMSC遷移至生精小管基底膜處，并表達精原干細胞和精原細胞標志物，如 Vasa、Stella、SMAD1、Dazl、GCNF、HSP90α、integrinβ1和c-kit等。另外，Ｒahmanifar等將異體BMMSC移植進白消安處理的大鼠一側睪丸，發現移植側的睪丸生精功能明顯優于未移植側。研究發現，一部分男性不育的原因是由于自身存在針對精子的抗體，從而引發自身免疫反應，Aghamir等將 BMMSC移植進創傷性睪丸破裂的Balb /c小鼠體內，發現BMMSC可抑制抗精子抗體的產生，具有免疫調節的作用，有望治療自身免疫引起的男性不育。

基于以上研究，Cai等進一步將BMMSC分泌的細胞因子進行超濾濃縮，注射進白消安處理的小鼠體內，結果顯示BMMSC的外泌因子能通過降低生精細胞凋亡、促進細胞間黏附因子表達，修復受損的生精功能。越來越多的研究表明，BMMSC移植入體內后雖然不能進行減數分裂，但能分泌營養因子、轉化為生殖細胞，改善局部的生精微環境，促進睪丸生精功能的恢復。

02 脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell，ADMSC) 治療男性不育

ADMSC是一種來源于脂肪組織的干細胞，與BMMSC特性相似，具有自我更新和多向分化潛能，可向神經細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞及內皮細胞等多種特定細胞類型分化。此外，還具有取材容易、來源廣泛、機體損傷小及增殖能力強等優點。自2001年Zuk等首次從脂肪組織中分離得到 ADMSC 后，迅速成為組織工程和再生醫學的研究熱點。

目前為止，與BMMSC相比，ADMSC應用于男性不育領域的研究報道較少。Cakici等將GFP標記的ADMSC移植到白消安處理的大鼠睪丸網，移植側睪丸形態正常，而未移植側睪丸萎縮，生精小管內基本為空腔。睪丸內可檢測到GFP + /VASA +和GFP + /SCP1 +雙陽性表達的細胞，提示移植的MSC在睪丸微環境中能向生殖細胞分化。經過ADMSC治療的大鼠，生精功能恢復，獲得連續子代。隨后，Mehrabani等的研究驗證了ADMSC的治療作用。將ADMSC顯微注射進不育大鼠的輸出小管，經過ADMSC移植的睪丸內生精小管形態學正常，而未移植的睪丸生精小管內呈空腔化。另外，ADMSC移植后的多數生精小管內能觀察到精子形成，說明ADMSC能改善生精微環境、修復不育大鼠的生精功能。

03 臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC) 治療男性不育

在臍帶動靜脈血管周圍的粘蛋白樣結締組織被稱為華爾通膠( Wharton＇s Jelly) ，從華爾通膠分離得到的基質細胞即為UCMSC，Sakamoto等于1996年首次從人臍帶華爾通膠中分離出UCMSC。在實際應用中，骨髓間充質干細胞BMMSC存在數量少、易老化等問題，廣泛應用受到一定的限制。而UCMSC細胞含量和增殖能力均優于BMMSC，且 UCMSC 分離自新生兒臍帶，倫理爭議低，同時，免疫原性也更低。基于UCMSC顯示出的優越性，越來越多的研究人員將其用于男性不育的治療。2010年Huang等通過含有全反式維甲酸、睪酮及睪丸細胞條件培養液對人UCMSC 進行體外誘導，觀察到人UCMSC分化成生殖細胞，并表達生殖細胞特異性標志物Oct4、c-kit、CD49f、Stella和 Vasa 等。后有學者進行了類似的研究，Xie等將人UCMSC與Sertoli細胞進行體外共培養，模擬體內微環境，結果顯示人UCMSC能分化為生殖細胞，并表達早期生殖細胞標志物Stella、Vasa及生殖細胞特異性標志物Dazl。Amidi等利用不同的體外環境，對UCMSC進行誘導，發現睪丸條件培養液和維甲酸的組合能使 c-kit、DDX4、Piwil2、Dazl等生殖細胞特異性基因表達顯著上調。

在上述研究的基礎上，有研究者將UCMSC顯微注射到白消安消除內源性精子的小鼠生精小管內，細胞示蹤顯示移植的UCMSC長期存活并遷移至生精小管基底膜，同時表達生殖細胞標志物，提示UCMSC移植入體內后能進一步向生殖細胞分化，生精小管的組織結構亦得到明顯修復。另有研究表明，UCMSC移植進動物體內后，并不能直接分化為精原細胞，更可能是通過旁分泌作用分泌營養因子，促進精子發生過程。

MSC治療男性不育的臨床前研究

近些年MSC已被廣泛應用于男性不育的臨床前研究，MSC動物體內移植后能夠長期存活并增殖，并遷移至生精小管基底膜，分泌營養因子，同時分化為生殖細胞和支持細胞，改善局部生精微環境，修復不育動物的生精功能。

MSC治療男性不育的臨床研究目前仍處于起步階段，截止到目前為止，美國Clinical Trials網站上MSC治療男性不育的研究有6項，國內臨床試驗注冊中心尚無MSC治療男性不育的相關研究，涉及的成體干細胞主要采用BMMSC、ADMSC，均處于臨床Ⅰ/Ⅱ期。

MSC的安全性

干細胞體內移植后，能夠歸巢到病灶部位發揮治療作用，但由于分化方向的不可控性，其安全性問題引發了人們的廣泛擔憂。這其中人們最關注的是干細胞的致瘤性。目前，學術界普遍認為，胚胎干細胞和誘導多能干細胞存在致瘤性風險。而截止目前尚未有MSC具有致瘤性的報道。

目前，全球范圍內已有十余個干細胞藥物上市，主要應用于移植物抗宿主病、心肌梗死、骨關節炎和肌萎縮側索硬化癥等適應癥。但MSC在男性不育領域的研究多處于臨床前研究階段，應用于臨床仍需一些時間。相信隨著研究的不斷深入，未來MSC能成為臨床上治療男性不育的有效手段。

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